ABC'nin sitcomlarından olan 8 Simple Rules dizisinde Bridget Hennessy rolünü canlandırarak, televizyon dünyasına giriş yaptı. Daha sonra başrol oyuncusu olarak Charmed dizisinde Billie Jenkis karakterini canladırdı. Charmed dizisi 2005 - 2006 yılları arasında yayında kaldı. Bu dizinden sonra sinema dünyasında tanındığı The Big Bang Theory dizisindeki Penny rolünü canlandırmaya başladı. Dizi kariyerinin yanında Lucky 13 (2005), The Penthouse (2010), ve Hop (2011) filmlerinde yer aldı.
The Big Bang Theory dizisinde rol arkadaşı Johnny Galecki ile 2 yıl kadar birliktelik yaşayan, bir dönem bağımlılık uzmanı Josh Resnik ile nişanlı kalan ve Man of Steel filminin Süpermen'i Henry Cavill ile birliktelikleri olan Cuoco, 2013 yılında Amerikalı tenis oyuncusu Ryan Sweeting ile birlikte olmaya başladı. İkili, 31 Aralık 2013'te evlendi, 2016'da ayrıldılar.