1982 yılında San Antonio, Texas'ta doğdu. Babası Gerald Polonya kökenlidir. 12 yaşındayken oyunculuk dersleri almaya başladı, 2000 yılında James Medison High School'dan mezun oldu. Başarılı bir öğrenci olan Padalecki, Texas Üniversitesi'nde eğitimine devam etmek istiyordu, ancak bunun yerine Los Angeles'a giderek aktörlük kariyeri kovalamayı tercih etti. 2000'de Gilmore Girls dizisine Dean Forester karakteriyle katıldı. Bu rolü 5 yıl sürdürdü. 2005 yılında Cry-Wolf, House of Wax gibi korku filmlerinde oynadı. 2005'te başlayan ve çok uzun yıllar devam eden Supernatural dizisinin başrollerinden biri olan Sam'i canlandırmaya başlamasıyla popülaritesini iyice arttırdı.

Padalecki, Cry-Wolf filminde tanıştığı Sandra McCoy'la 2008'de nişanlandı, ancak aynı yıl içinde yollarını ayırdılar. Bir başka oyuncu Genevieve Cortese ile 2010'da evlenen Padalecki'nin Thomas Colton (d. 2012) ve Austin Shepherd "Shep" (d. 2013) adlarında iki oğlu, Odette Elliott (d. 2017) adında bir kızı bulunmaktadır.